不同消毒劑對(duì)禽舍細(xì)菌氣溶膠多樣性的影響

        為了更好地了解不同消毒劑對(duì)肉雞舍微生物種類和數(shù)量的影響，使用了臭氧、有效氯、季銨鹽、戊二醛和混合消毒劑等五種不同類型的消毒劑。通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)合空氣采樣分析肉雞舍微生物群落。結(jié)果表明，與未使用消毒劑的雞舍相比，施用不同消毒劑的空雞舍空氣中需氧菌濃度顯著降低（P < 0.05或P< 0.01), 消毒后可吸入空氣中需氧菌顆粒數(shù)急劇下降。在五種消毒劑中，混合消毒劑對(duì)總微生物群落的消毒效果很好（P < 0.05）。高通量測(cè)序共獲得508143個(gè)高質(zhì)量序列，確定了1995個(gè)可操作的分類單元?？偣茶b定出 42 個(gè)門和 312 個(gè)屬。施用不同消毒劑后肉雞舍內(nèi)空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)不同。在混合消毒劑處理的房屋中，微生物群落中含有機(jī)會(huì)致病菌，如大腸桿菌、志賀氏桿菌、芽孢桿菌和假單胞菌，豐度很低，與未經(jīng)消毒劑處理的房屋相比，豐度顯著降低。α多樣性指數(shù)顯示，混合消毒劑處理的雞舍內(nèi)微生物群落多樣性較低。與其他四種消毒劑相比，混合消毒劑處理過(guò)的房屋的空氣樣本中僅檢測(cè)到少量細(xì)菌；具體來(lái)說(shuō)，只發(fā)現(xiàn)了四個(gè)門（變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門）?；旌舷緞?duì)四個(gè)門類的消毒產(chǎn)生了積極的影響；但是，它并沒(méi)有徹底消除它們。在屬水平上，芽孢桿菌屬、Arenimonas和Shinella用混合消毒劑處理過(guò)的雞舍檢測(cè)不到，用其他消毒劑處理過(guò)的雞舍檢測(cè)到。高通量測(cè)序結(jié)果表明，多種消毒劑聯(lián)合使用具有良好的消毒效果，該技術(shù)可以對(duì)肉雞舍的空氣進(jìn)行消毒。這些結(jié)果將有助于指導(dǎo)制定合理的肉雞舍消毒方案。

介紹

近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的不斷提高，圈養(yǎng)動(dòng)物的密度不斷增加。此外，動(dòng)物傳染病的傳播正在加速，各種動(dòng)物流行病已經(jīng)出現(xiàn)（Wu et al., 2012 ; Mellata, 2013 ; Mughini-Gras et al., 2014 ; Threlfall et al., 2014 ; Barbosa et al. ，2017 年；Poulsen 等人，2017 年；Stromberg 等人，2017 年；Vinayananda 等人，2017 年）。因此，畜禽舍的消毒已成為防治疾病的重要措施。肉雞舍常用的化學(xué)消毒劑包括有效氯、臭氧、季銨鹽和戊二醛（Meroz 和 Samberg，1995 年；Saklou 等人，2016 年；Chidambaranathan 和 Balasubramanium，2017 年）。用于肉雞舍大規(guī)模消毒的不同消毒劑作用機(jī)制不同，因此其消毒效果也不同（Suwa et al., 2013 ; Chidambaranathan and Balasubramanium, 2017 ; Maertens et al., 2017））。目前，含氯化合物（二氯異氰尿酸鈉、次氯酸鈉、漂白粉、二氧化氯等）廣泛用作畜禽生產(chǎn)中的消毒劑（Van Klingeren，1995；Boxall等，2003）。有效氯能有效殺滅結(jié)核桿菌、腸桿菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。低濃度的尼日爾孢子（Boxall 等人，2003 年；Hakuno 等人，2010 年；Suwa 等人，2013 年）。

        許多研究表明，含氯化合物可以通過(guò)改變微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來(lái)殺死微生物（Venkobachar et al., 1977 ; Virto et al., 2005 ; Liu et al., 2006 ; Berg et al., 2010）。臭氧是一種三原子氣態(tài)分子，可作為強(qiáng)氧化劑，已在醫(yī)學(xué)中使用了 150 多年（Elvis 和 Ekta，2011 年）。臭氧因其有效的抗菌功能 ( Ozturk et al., 2017 ) 和抗氧化防御 ( Delgadoroche et al. , 2017) 而具有廣泛的醫(yī)療應(yīng)用）。革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)臭氧更敏感，而細(xì)菌比測(cè)試過(guò)的酵母菌株更敏感（Moore 等人，2000 年）。雅各布斯和海德堡 (1915)首次合成具有殺菌能力的季銨鹽化合物。季銨鹽的殺菌機(jī)制涉及改變細(xì)胞通透性，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物外滲。季銨鹽是一種陽(yáng)離子表面活性劑。鑒于陽(yáng)離子表現(xiàn)出基于親脂性的殺菌作用，并且革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比革蘭氏陰性菌含有更多的脂質(zhì)，因此革蘭氏陽(yáng)性菌更容易被季銨鹽滅活。戊二醛可以直接作用于細(xì)菌的蛋白質(zhì)和酶，從而影響細(xì)菌的新陳代謝，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。戊二醛還可以防止細(xì)菌孢子外層釋放二鹽酸鹽，防止孢子形成。所以，Battersby 等人，2017 年；卡斯特羅等人，2017 年）。戊二醛殺菌譜廣，對(duì)細(xì)菌和病毒具有高效殺滅能力。戊二醛對(duì)梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的孢子也有很強(qiáng)的作用，可引起壞死性腸炎，因此常用于流行病期間細(xì)菌孢子的消毒（Miner et al., 1993 ; Rutala et al., 1993 ; Brantner et al . ., 2014 年）。

        在集約化養(yǎng)殖過(guò)程中，家畜和家禽可以通過(guò)糞便和呼吸道排出細(xì)菌和病毒，包括機(jī)會(huì)性病原體，并在空氣中產(chǎn)生生物氣溶膠，可能危害人類和環(huán)境（Hojovec 和 Fiser，1968 年；Bessarabov 等人， 1972 年；Petkov 和 Tsutsumanski，1975 年；Petkov 和 Ba?kov，1984 年；Petkov 等人，1987 年；Just 等人，2011a，b）。雞被轉(zhuǎn)移或淘汰后，空的肉雞舍受到不同程度的污染?？瘴菹臼且?guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)防治疾病的重要一步。消毒可以減少或殺死雞舍內(nèi)潛在的病原微生物，防止病原微生物在批次間傳播。不同的消毒程序有不同的效果，因此選擇合適的消毒劑以及消毒程序和方法可以有效控制禽舍傳染病的發(fā)生。這些方法主要包括清洗、浸泡、熏蒸、噴涂和紫外線照射。霧化消毒劑已經(jīng)應(yīng)用了半個(gè)多世紀(jì)。氣溶膠可以節(jié)約材料，形成消毒氣溶膠-消毒劑蒸氣系統(tǒng)（Wichelhaus 等人，2006 年；卡瓦略等人，2015 年；Saklou 等人，2016 年）。應(yīng)用超聲霧化技術(shù)，可將液體霧化成氣溶膠狀態(tài)，獲得均勻分散的2~4 μm液滴。霧化后的液滴起到“種子粒子”的作用，在氣溶膠中形成聚集核，可以與周圍的細(xì)小顆粒有效碰撞，提高聚集效率。消毒劑霧化后，空氣中散發(fā)出大量水蒸氣，增加室內(nèi)相對(duì)濕度，提高消毒劑對(duì)細(xì)菌壁的滲透能力，增強(qiáng)消毒效果，減少消毒時(shí)間（Mu?oz等., 2017 年）。

        理想的消毒劑應(yīng)具有良好的殺滅病原微生物的能力；性質(zhì)穩(wěn)定，不易受水質(zhì)、有機(jī)物等物理化學(xué)因素的影響；有效控制養(yǎng)雞場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生。因此，檢測(cè)空屋消毒后殘留的微生物是評(píng)價(jià)消毒效果的重要手段。許多方法可用于微生物氣溶膠檢測(cè)，例如微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)、直接顯微檢測(cè)、生物傳感器技術(shù)和基因芯片技術(shù)。這些方法是傳統(tǒng)的，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)不易培養(yǎng)或空氣中含量低的微生物。高通量 DNA 測(cè)序方法可用于通過(guò) 16S rRNA 序列分析來(lái)表征微生物系統(tǒng)。(Korajkic 等人，2015 年；賈等人，2016 年）。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于能夠檢測(cè)培養(yǎng)方法難以獲得的微生物；因此，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域（O'Brien et al., 2014 ; Tian et al., 2017）。高通量測(cè)序技術(shù)可用于評(píng)估消毒對(duì)空屋內(nèi)微生物分布和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。本研究采用五種常用消毒劑對(duì)禽舍進(jìn)行消毒。通過(guò) 16s rRNA 的高通量測(cè)序分析了處理后存在的微生物群的組成，并與未處理房屋中的微生物群進(jìn)行了比較。研究了不同消毒劑對(duì)空置肉雞舍內(nèi)微生物數(shù)量和多樣性的影響。本研究為消毒劑在疾病預(yù)防中的正確應(yīng)用和消毒程序的制定提供參考。

結(jié)果與分析

消毒劑處理和未處理的肉雞舍內(nèi)好氧菌的含量和粒徑分布

未經(jīng)處理和用消毒劑處理的肉雞舍中的氣溶膠濃度如圖2所示。經(jīng)過(guò)處理的房屋的細(xì)菌負(fù)荷低于未經(jīng)處理的房屋。經(jīng)不同消毒劑處理后，有效氯和混合消毒劑處理的肉雞舍細(xì)菌氣溶膠濃度很高和很低，分別為7.67×10 2 cfu/m 3和0.22×10 2 cfu/m 3。顯然，混合消毒劑對(duì)培養(yǎng)細(xì)菌的效果優(yōu)于其他四種消毒劑（P < 0.05）。

圖 1.未經(jīng)處理和經(jīng)消毒劑處理的空氣中的細(xì)菌總數(shù) ( n = 9)。A：無(wú)需消毒；B：臭氧；C：有效氯；D：季銨鹽；E：戊二醛；F：混合消毒劑。

如表1所示，與未經(jīng)處理的雞舍相比，經(jīng)消毒劑處理的肉雞舍中空氣中需氧菌的粒徑分布發(fā)生了顯著變化。從 Andersen-6 集塵器的 III-VI 階段開始，用不同消毒劑處理的肉雞舍中空氣中需氧菌的分布有所減少。與未用消毒劑處理的空雞舍相比，有效氯、季銨鹽、戊二醛和混合消毒劑消毒的肉雞舍在Ⅲ~Ⅵ階段的分布顯著降低。在混合消毒劑處理的肉雞舍中，V-VI階段空氣中需氧菌的比例較消毒前的比例從35.1%顯著下降到0%，戊二醛從35.1下降到1%。

表 1.未經(jīng)消毒劑處理和處理過(guò)的細(xì)菌的分級(jí)分布。

通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行序列分析

在對(duì)空氣傳播細(xì)菌中細(xì)菌 16S rRNA 基因的 V4-V5（515F-907R）區(qū)域進(jìn)行測(cè)序后，樣本中的原始序列總數(shù)為 531,093。過(guò)濾低質(zhì)量序列后，有效序列總數(shù)為508,143。在對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量控制后，將序列聚類到 OTU 中，以 97% 的同一性進(jìn)行分類。所有樣本共產(chǎn)生 1995 個(gè) OTU（補(bǔ)充表S1），平均長(zhǎng)度為 372 bp。每個(gè)樣品的序列信息如表2 所示。

表 2.樣品的序列信息。

微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在微生物分類門水平（圖2A)，未處理或經(jīng)五種消毒劑處理的肉雞舍內(nèi)采集的空氣傳播微生物主要包括變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門。這些門經(jīng)臭氧、有效氯、戊二醛和混合消毒劑處理后占優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度分別為99.0、97.9、99.8和99.9%。未經(jīng)消毒劑處理或消毒劑處理的肉雞舍中空氣傳播的微生物在門水平上存在差異。未經(jīng)處理的雞舍總共有 32 個(gè)門，而用臭氧、有效氯、季銨鹽、戊二醛和混合消毒劑處理的肉雞雞舍的門數(shù)分別為 21、27、28、17 和 6 個(gè). 使用混合消毒劑后OTU的相對(duì)豐度很低。

圖 2.門水平(A)和屬水平(B)的群落分類組成和豐度分布。a、臭氧；b、有效氯；c、季銨鹽；d、戊二醛；e、混合消毒劑；f、未經(jīng)消毒。

微生物群落多樣性分析

采用 Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)評(píng)估樣品中微生物物種的豐度和多樣性（表3）。不同樣本的多樣性指標(biāo)不同。未經(jīng)消毒的肉雞舍的多樣性指數(shù)高于其他雞舍的指數(shù)，說(shuō)明未經(jīng)消毒的肉雞舍的生物多樣性比較豐富。但經(jīng)混合消毒劑處理后，肉雞舍樣品的Chao 1和ACE豐度指數(shù)較其他樣品有所下降。混合消毒劑的多樣性指數(shù)很低，表明其消毒效果優(yōu)于其他消毒劑。此外，主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示各個(gè)樣本之間存在明顯的聚類，來(lái)自未處理房屋的樣本聚集在一起并與其他處理房屋樣本分離（補(bǔ)充圖S1）。

表 3.樣品中細(xì)菌 α 多樣性的統(tǒng)計(jì)分析。

聚類分析

基于可在門級(jí)別分類的 35 種不同分類法構(gòu)建了熱圖（圖3 ）。圖中的每個(gè)小方框代表樣本中某個(gè)細(xì)菌門的相對(duì)豐度。更強(qiáng)烈的紅色代表增加的相對(duì)豐度。如熱圖所示，不同樣品中微生物群落的組成不同。未經(jīng)處理的肉雞舍空氣中微生物群落豐度很高，多種消毒劑聯(lián)合處理后該豐度明顯下降。

圖3.門級(jí)細(xì)菌的相對(duì)豐度。a、臭氧；b、有效氯；c、季銨鹽；d、戊二醛；e、混合消毒劑；f、未經(jīng)消毒。熱圖基于行Z分?jǐn)?shù)進(jìn)行顏色編碼。比例尺是六個(gè)樣品中細(xì)菌相對(duì)百分比的標(biāo)準(zhǔn)化Z值。顏色代碼表示相對(duì)豐度，范圍從藍(lán)色（低豐度）到黃色到紅色（高豐度）。